Langkah pertama: Fiksasi
Pada tahap fiksasi, langkah fiksatif digunakan untuk memodifikasi jaringan dengan menstabilkan protein, sehingga tahan terhadap perubahan selanjutnya; dengan demikian, langkah fiksatif digunakan untuk melindungi jaringan dari degradasi dan untuk mempertahankan struktur sel, termasuk komponen subseluler, seperti organel sel (nukleus, retikulum endoplasma, dan mitokondria).
Langkah Kedua: Pengolahan
Dalam tahap pengolahan, jaringan harus melalui proses dehidrasi untuk menggantikan air dengan materi yang kelak akan digunakan untuk proses penyisipan, sehingga sampel jaringan memasuki bahan penyisipan. Teknik yang sering digunakan adalah penyisipan lilin parafin.
Sampel direndam dalam berbagai rendaman etanol yang makin terkonsentrasi untuk menghilangkan air dari jaringan, dilanjutkan dengan cairan pembersih, seperti xylene, Untuk menghilangkan alkohol dan akhirnya memanaskan lilin parafin, yang akan menggantikan xylene memasuki jaringan.
Tahap Ketiga: Penyisipan
Dalam proses penyisipan, Sampel jaringan dan bahan cair yang disisipkan kemudian ditempatkan di dalam cetakan dan dibiarkan sampai mengeras. Hasil cetakan yang mengandung sampel jaringan tersebut siap untuk dipilah. Proses penyisipan juga bisa menggunakan jaringan beku yang tidak tetap dengan media berbasis air, biasanya dengan glikol berbasis air atau resin.
Tahap Empat: Pemisahan
Dalam fase pemisahan ini, Jaringan dipotong menjadi bagian yang sangat tipis (0.5 - 10 micron; 1000 micron = 1mm) menggunakan mikrotom. Potongan-potongan ini, biasanya lebih tipis daripada sel pada umumnya, Yang kemudian ditempatkan di dalam sebuah gelas untuk proses pewarnaan. Jaringan beku yang tertanam di media pembekuan dipotong menggunakan mikrotom dalam sebuah cryostat.
Tahap Kelima: Pewarnaan
Pewarnaan secara rutin dilakukan untuk memberi kontras kepada jaringan yang diteliti. Hematoksilin dan eosin (H&E) adalah pewarna yang sering digunakan dalam histologi.
- Hematoxylin dikombinasikan dengan logam mordan, seperti aluminium, dan kombinasi hematoxylin-aluminum digunakan untuk mewarnai sel inti biru/ hitam.
- Eosin adalah anti noda yang paling sering digunakan dalam proses pewarnaan rutin pada jaringan bagian. Pewarnaan terbaik dengan eosin terjadi pada pH 4,5 sampai 5, dan bila digunakan dengan benar, setidaknya tiga warna merah muda dapat diperoleh. Eritrosit, kolagen, dan sitoplasma sel epitel atau sel otot harus menghasilkan corak warna merah muda yang berbeda saat menggunakan eosin.
Terdapat teknik lain yang dapat digunakan secara selektif untuk memberikan warna pada sel dan komponen seluler.
